PUREfrex®是一系列重組無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成試劑，重組系統(tǒng)只與轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)因素有關(guān)，使用者可以根據(jù)需要來(lái)自由調(diào)整反應(yīng)混合物的成分，由于它只含有已知的蛋白質(zhì)和底物，因此在下游應(yīng)用中不必考慮高背景的影響。

什么是PURE？

PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements)系統(tǒng)技術(shù)是由東京大學(xué)的Takuya Ueda教授發(fā)明的重組無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。

該反應(yīng)系統(tǒng)僅由蛋白質(zhì)、核糖體、氨基酸和NTPs組成。這些蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)錄、翻譯、氨酰化和能量再生所必需的。所有的蛋白因子和核糖體都是單獨(dú)高度純化的，并在緩沖液中與底物如氨基酸、NTPs和tRNAs組裝。翻譯因子包括: 起始因子IF1/IF2/IF3，延伸因子EF-Tu/EF-Ts/EF-G，釋放因子RF1/RF2/RF3，核糖體再循環(huán)因子(RRF)，20種氨酰tRNA合成酶(ARS)，甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶。

圖1. PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements)系統(tǒng)技術(shù)示意圖

該系統(tǒng)是僅由轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)組成的，不像其他使用細(xì)胞裂解物的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。該系統(tǒng)沒(méi)有未知蛋白質(zhì)，成分可以隨客戶需要調(diào)整。

什么是PUREfrex？

PUREfrex是基于PURE系統(tǒng)技術(shù)的產(chǎn)品，該試劑盒主要由3種試劑組成。溶液I包含氨基酸、NTPs、其他小分子化合物和tRNAs。溶液II包含RNA聚合酶、翻譯因子和其他蛋白質(zhì)。溶液III含有純化的核糖體。將純化的組分以達(dá)到最大蛋白質(zhì)合成活性的濃度混合。對(duì)于蛋白質(zhì)合成，將編碼自己感興趣的蛋白質(zhì)的DNA(或mRNA)加入到溶液I、II和III的混合物中，然后孵育反應(yīng)混合物。PUREfrex減少了與蛋白質(zhì)合成無(wú)關(guān)的污染物。例如，來(lái)自大腸桿菌的脂多糖減少到每ul反應(yīng)混合物約0.1 EU。核糖核酸酶、β-半乳糖苷酶和其他污染蛋白的量也減少了。PUREfrex試劑中包含的所有翻譯因子和其他蛋白質(zhì)不包含任何標(biāo)簽序列。這使得可以使用任何標(biāo)簽序列來(lái)純化和檢測(cè)合成的蛋白質(zhì)。

圖2. PUREfrex與原始PURE系統(tǒng)中污染物比較

PUREfrex®試劑盒總共有3個(gè)系列：PUREfrex®1.0；PUREfrex®2.0；PUREfrex®2.1。

PUREfrex®1.0

2011年推出，反應(yīng)溶液的成分信息是公開(kāi)的，適用于產(chǎn)品定制等需要明確組成成分信息的研究。雖然使用 PUREfrex® 2.0 合成蛋白時(shí)的速度較快，但可能無(wú)法及時(shí)形成和折疊二硫鍵等導(dǎo)致不溶，此時(shí)使用合成速度較慢的PUREfrex® 1.0 效果可能更好。

PUREfrex®2.0

2015年推出，PUREfrex® 2.0改進(jìn)了從大腸桿菌中純化的所有組分的制備方法，并優(yōu)化了因子的組成，使PUREfrex 2.0實(shí)現(xiàn)了比PUREfrex 1.0高2-10倍的蛋白質(zhì)生產(chǎn)率。適用于需要合成大量蛋白及多種蛋白的研究。反應(yīng)液成分信息保密。

PUREfrex®2.1

于2017年推出，在保留PUREfrex® 2.0 反應(yīng)液組成的基礎(chǔ)上，單獨(dú)添加了還原劑，因此可根據(jù)添加的還原劑（和氧化劑）種類和數(shù)量來(lái)調(diào)整合成過(guò)程中的氧化還原狀態(tài)。適用于需嚴(yán)格控制氧化還原狀態(tài)的含二硫鍵結(jié)合的蛋白合成。

圖3.PUREfrex® 1.0和PUREfrex® 2.0對(duì)比數(shù)據(jù)

圖4.PUREfrex®2.0和PUREfrex®2.1成分對(duì)比

產(chǎn)品信息

應(yīng)用

使用PUREfrex®可合成各種活性蛋白，包括原核蛋白、真核蛋白、膜蛋白、含二硫鍵的蛋白質(zhì)、含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。PUREfrex®可用于以下研究領(lǐng)域，適用于各種蛋白質(zhì)的小規(guī)模、高通量合成，也是蛋白質(zhì)功能評(píng)估的機(jī)器學(xué)習(xí)平臺(tái)的理想選擇。

1. 核糖體展示技術(shù)

2. mRNA展示技術(shù)

3. 蛋白翻譯機(jī)制研究

4. 蛋白質(zhì)合成后的折疊

蛋白合成添加劑

根據(jù)您的蛋白質(zhì)的性質(zhì)，可以選擇不同的添加劑，添加到PUREfrex®試劑盒中，改善蛋白的折疊和溶解性。

1.分子伴侶

分子伴侶像hsp70（如E. coli DnaK）有助于合成蛋白質(zhì)的正確折疊。由于PUREfrex®試劑盒不含任何分子伴侶，一些蛋白質(zhì)可能難以形成正確的構(gòu)象，合成后為不溶性。在這種情況下，添加分子伴侶可能有助于增加溶解性和活性。

2.形成二硫鍵

對(duì)于某些蛋白質(zhì)，如分泌蛋白，二硫鍵的形成對(duì)其穩(wěn)定性或活性很重要。二硫鍵通常是由相鄰半胱氨酸殘基的巰基（SH-）氧化形成的。因此，氧化環(huán)境是形成二硫鍵所必需的。此外，二硫鍵異構(gòu)酶（如E. coli DsbC）可以催化二硫鍵交換，也是形成半胱氨酸正確配對(duì)所必需的。

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